2021/06/07 使用Sartoclear Dynamics過濾系統進行慢病毒載體的澄清和收穫!
目前已有三千多項關於病毒載體正在進行臨床試驗,其中約10%是以慢病毒載體進行的。慢病毒載體通常是透過多種質體載體瞬時轉染到HEK293T細胞而產生的,病毒會釋放到上清液中,因此要將細胞培養液中的細胞/雜質移除,而在CAR-T研究中則是缺乏建立LV澄清的黃金方法。常規標準使用以離心機分離再進行上清液微孔濾膜澄清,但是僅透過單一步驟的過濾再加上DE助濾劑的輔助,將可有效捕獲和澄清LV,且提高LV純化和T細胞轉導效率。
實驗目的和總結: 主要使用含有矽藻土(DE)之Sartoclear Dynamics® Lab V50來澄清懸浮細胞HEK293產生的慢病毒載體(Lentiviral vectors, LV),透過使用實驗設計(DOE)分析Sartoclear Dynamics®Lab V50和與標準法比較,結果發現:
1. 高濃度DE雖降低感染力價,但有利降低濁度和加快過濾時間。 2. 較低濃度DE有利回收高LV力價。 3. 與標準法比,Sartoclear Dynamics®Lab V50可更好的將濁度/汙染物降低、提升過濾能力和提升整體膜的使用容量。 4. 相比標準法,更快、更安全進行處理,且減少耗材使用量。 5. Sartoclear Dynamics®Lab V50適用於捕獲和澄清慢病毒載體。
實驗結果: 一、使用MODDE® software (Sartorius)在DOE研究中評估DE濃度和接觸時間對濁度、感染力價和過濾時間的影響: 1. 當DE濃度升高,感染力價呈線性下將。 2. 隨著DE濃度的增加,過濾時間減少。 3. 隨著樣品與DE的接觸時間越長,濁度線性降低。![jxf吉祥官网总站](/files/sa-1.png)
二、評估Sartoclear Dynamics®Lab V50對處理時間的影響: 1. 使用標準法,大約25ml後,第一個Sartolab®RF50過濾器堵塞,因此需使用第二個Sartolab®RF50將剩餘液體過濾,費時費力。 2. 使用Sartoclear Dynamics®Lab V50因不需再進行離心,可有效降低總處理時間3.8倍。![jxf吉祥官网总站](/files/sa-2.png)
三、評估Sartoclear Dynamics®Lab V50對濁度和過濾器容量的影響: 1. 標準法:濁度可至43NTU (89 %降低)。 2. 使用Sartoclear Dynamics® Lab V50 (5g/L DE),可將濁度降到21NTU(95%降低)。 3. 搭配最少量5g/L之DE,來確認澄清過濾器的容量,直到過濾阻塞為止,發現Sartoclear Dynamics®Lab V50 可裝置超過50ml的容量,標準僅約過濾33ml時發生阻塞。
四、評估Sartoclear Dynamics®Lab V50去除雜質的影響: 1. 約10 g/L的DE會增加蛋白質和dsDNA的移除。 2. 10 g/L~40 g/L之間的較高DE濃度,移除能力沒有明顯增加。 3. 與常規離心後,再澄清方法相比,不論DE濃度為何皆顯著提高雜質移除濾。
★最後跟大家複習如何操作Sartoclear吧!
將矽藻土倒入細胞培養液中進行均勻混合→將過濾裝置與真空馬達相連接→將含有矽藻土之細胞培養液倒入過濾裝置→真空過濾→過濾即完成。
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實驗目的和總結: 主要使用含有矽藻土(DE)之Sartoclear Dynamics® Lab V50來澄清懸浮細胞HEK293產生的慢病毒載體(Lentiviral vectors, LV),透過使用實驗設計(DOE)分析Sartoclear Dynamics®Lab V50和與標準法比較,結果發現:
1. 高濃度DE雖降低感染力價,但有利降低濁度和加快過濾時間。 2. 較低濃度DE有利回收高LV力價。 3. 與標準法比,Sartoclear Dynamics®Lab V50可更好的將濁度/汙染物降低、提升過濾能力和提升整體膜的使用容量。 4. 相比標準法,更快、更安全進行處理,且減少耗材使用量。 5. Sartoclear Dynamics®Lab V50適用於捕獲和澄清慢病毒載體。
實驗結果: 一、使用MODDE® software (Sartorius)在DOE研究中評估DE濃度和接觸時間對濁度、感染力價和過濾時間的影響: 1. 當DE濃度升高,感染力價呈線性下將。 2. 隨著DE濃度的增加,過濾時間減少。 3. 隨著樣品與DE的接觸時間越長,濁度線性降低。
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二、評估Sartoclear Dynamics®Lab V50對處理時間的影響: 1. 使用標準法,大約25ml後,第一個Sartolab®RF50過濾器堵塞,因此需使用第二個Sartolab®RF50將剩餘液體過濾,費時費力。 2. 使用Sartoclear Dynamics®Lab V50因不需再進行離心,可有效降低總處理時間3.8倍。
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三、評估Sartoclear Dynamics®Lab V50對濁度和過濾器容量的影響: 1. 標準法:濁度可至43NTU (89 %降低)。 2. 使用Sartoclear Dynamics® Lab V50 (5g/L DE),可將濁度降到21NTU(95%降低)。 3. 搭配最少量5g/L之DE,來確認澄清過濾器的容量,直到過濾阻塞為止,發現Sartoclear Dynamics®Lab V50 可裝置超過50ml的容量,標準僅約過濾33ml時發生阻塞。
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四、評估Sartoclear Dynamics®Lab V50去除雜質的影響: 1. 約10 g/L的DE會增加蛋白質和dsDNA的移除。 2. 10 g/L~40 g/L之間的較高DE濃度,移除能力沒有明顯增加。 3. 與常規離心後,再澄清方法相比,不論DE濃度為何皆顯著提高雜質移除濾。
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