2023/02/09 核酸定量之方法比較
核酸包含了人類生命的所有信息。自從過去幾十年被發現以來,從低通量到高通量的各種方法都依賴於準確核酸量的應用,因此核酸定量方法的選擇便非常重要。核酸定量方法主要可分為UV-Vis吸光值測量和螢光測量,它們是樣品定量和質量控制的互補測量技術。 UV-Vis 吸光值測量是生命科學實驗室中純化生物分子定量的標準方法。 該方法根據分子在特定波長下(220-360 nm)的吸光值曲線快速檢測分子(圖一)。
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圖一:在 BMG LABTECH 微孔盤判讀儀使用 UV/vis 吸光值進行 DNA 定量(藍線:pure water ;紅線:DNA )
螢光測量是利用熒光團與核酸結合時發出螢光,並透過螢光分子與標準濃度核酸混合並測量相對螢光單位(RFU)以繪製出濃度與測量值之標準曲線,根據該標準曲線以確定未知樣品之濃度(圖二)。
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圖二:在 BMG LABTECH 微孔盤判讀儀使用螢光進行 DNA 定量
BMG Labtech 利用超微量孔盤(Lvis Plate)、96 well 微孔板以及 384 well 微孔板在微孔盤判讀儀上進行 UV-Vis 吸光值測量和螢光測量(Qubit™ 和 Quant-iT™/PicoGreen™)以比較不同的測量方式(圖三)。
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圖三:在 VANTAstar、FLUOstar Omega 和 CLARIOstar Plus 上比較 UV/vis 吸光值測量和螢光測量的 DNA 定量結果
由以上結果可觀察到螢光測量之 DNA 濃度範圍為 1 pg -10 μg,然而 UV-Vis 吸光值測量之 DNA 濃度範圍只有 10 ng - 10 μg。雖然螢光測量範圍遠高於 UV-Vis 吸光值測量,且有較高之靈敏度,只是因為螢光測量的準備時間以及測量時間比 UV-Vis 吸光值測量來得長,並且測量值較易受到溫度改變影響。然而,UV-Vis 吸光值測量雖範圍較低,但無需任何試劑並可直接進行測量,且測量速度快。 由此可見,吸光值測量和螢光測量兩者皆有優劣之處,因此需根據實驗中核酸樣品實際的狀況去選擇合適的方式。例如,若實驗中獲得的核酸樣品較為純淨且產量較高時,UV-Vis 吸光值測量為首選的方法。相反,若實驗中獲得的核酸樣品易受污染或產量較低時,卻較適合使用螢光測量,因為螢光測量可以檢測濃度比傳統吸光度低數百倍外,並且螢光分子與核酸具有高度特異性結合,因此可避免樣品中污染物對核酸定量造成干擾。
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表一:UV/vis 吸光值測量和螢光測量之優劣之處
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圖一:在 BMG LABTECH 微孔盤判讀儀使用 UV/vis 吸光值進行 DNA 定量(藍線:pure water ;紅線:DNA )
螢光測量是利用熒光團與核酸結合時發出螢光,並透過螢光分子與標準濃度核酸混合並測量相對螢光單位(RFU)以繪製出濃度與測量值之標準曲線,根據該標準曲線以確定未知樣品之濃度(圖二)。
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圖二:在 BMG LABTECH 微孔盤判讀儀使用螢光進行 DNA 定量
BMG Labtech 利用超微量孔盤(Lvis Plate)、96 well 微孔板以及 384 well 微孔板在微孔盤判讀儀上進行 UV-Vis 吸光值測量和螢光測量(Qubit™ 和 Quant-iT™/PicoGreen™)以比較不同的測量方式(圖三)。
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圖三:在 VANTAstar、FLUOstar Omega 和 CLARIOstar Plus 上比較 UV/vis 吸光值測量和螢光測量的 DNA 定量結果
由以上結果可觀察到螢光測量之 DNA 濃度範圍為 1 pg -10 μg,然而 UV-Vis 吸光值測量之 DNA 濃度範圍只有 10 ng - 10 μg。雖然螢光測量範圍遠高於 UV-Vis 吸光值測量,且有較高之靈敏度,只是因為螢光測量的準備時間以及測量時間比 UV-Vis 吸光值測量來得長,並且測量值較易受到溫度改變影響。然而,UV-Vis 吸光值測量雖範圍較低,但無需任何試劑並可直接進行測量,且測量速度快。 由此可見,吸光值測量和螢光測量兩者皆有優劣之處,因此需根據實驗中核酸樣品實際的狀況去選擇合適的方式。例如,若實驗中獲得的核酸樣品較為純淨且產量較高時,UV-Vis 吸光值測量為首選的方法。相反,若實驗中獲得的核酸樣品易受污染或產量較低時,卻較適合使用螢光測量,因為螢光測量可以檢測濃度比傳統吸光度低數百倍外,並且螢光分子與核酸具有高度特異性結合,因此可避免樣品中污染物對核酸定量造成干擾。
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表一:UV/vis 吸光值測量和螢光測量之優劣之處