2022/09/19 基因工程產品的內毒素去除方法
內毒素是一種存在於革蘭氏陰性菌外膜的脂多醣(lipopolysaccharide,LPS),由 O-antigen、core oligosaccharide和lipid A組成。雖然LPS對細菌來說主要是作為保護作用和組成結構,但對於生物體會引起發燒、腹瀉甚至死亡,因此目前對用於治療的相關藥物、器具及耗材都被認定需要做內毒素控管。LPS在結構特性上是具有淨負電荷的化學穩定分子,可以抵抗高壓、極端溫度和 pH 值,單體的分子量為10-20 kDa,在水溶液中,尤其當二價陽離子存在時,如 Ca2+ 和 Mg2+,可形成穩定的聚集體(Micelles)。當洗滌劑(Detergent)存在時,有助於將LPS聚集體分解成更小的結構(sub-units),是目前針對蛋白質樣品最常使用的LPS去除方法。然而當洗滌劑存在時,除了會影響樣品的純度與效能,可能會導致後續對於內毒素含量分析時的干擾,因此如何以最少量的去汙劑有效達到去除LPS,成為製程上的一個重要的衡量因素。
Adeno-associated virus (AAV)是一種將單鏈DNA (ssDNA)基因組整合到蛋白質外殼中的病毒,常用於將特定DNA遞送至目標細胞的基因工程試驗,被認為是基因治療最安全的策略之一。不過在整個試驗的過程中,非常容易受到來自一般實驗材料、環境中LPS污染,及最直接的是來自E. coil純化出的plasmid DNA。在文獻中顯示,以含有0.5%洗滌劑(Triton X-100 or Na-DC)並且經37 ℃預熱的PBS緩衝液,混合樣品後在37 ℃持續作用30分鐘,達2次處理,有助於將LPS從中分離。接著以高鹽(0.2M NaCl)緩衝液進行清洗殘留的洗滌劑達3次,以100 k的濃縮管(Sartorius # VS2042)在轉速2,000 xg下收集AAV。此流程有助於將 LPS 從大約 1,000 EU/mL 降低到低於 2.5 EU/mL 的含量。
![jxf吉祥官网总站](/files/圖一 Recombinant AAV樣品的LPS去除流程.jpg)
![jxf吉祥官网总站](/files/圖二 CMC-535™ Aaasy _G-Bioscience_.jpg)
Adeno-associated virus (AAV)是一種將單鏈DNA (ssDNA)基因組整合到蛋白質外殼中的病毒,常用於將特定DNA遞送至目標細胞的基因工程試驗,被認為是基因治療最安全的策略之一。不過在整個試驗的過程中,非常容易受到來自一般實驗材料、環境中LPS污染,及最直接的是來自E. coil純化出的plasmid DNA。在文獻中顯示,以含有0.5%洗滌劑(Triton X-100 or Na-DC)並且經37 ℃預熱的PBS緩衝液,混合樣品後在37 ℃持續作用30分鐘,達2次處理,有助於將LPS從中分離。接著以高鹽(0.2M NaCl)緩衝液進行清洗殘留的洗滌劑達3次,以100 k的濃縮管(Sartorius # VS2042)在轉速2,000 xg下收集AAV。此流程有助於將 LPS 從大約 1,000 EU/mL 降低到低於 2.5 EU/mL 的含量。
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圖一 Recombinant AAV樣品的LPS去除流程
在整個洗滌過程中,使用CMC-535™ Detergent Assay (G-Bioscience)進行洗滌劑定量,由於與 CMC-535™螢光染劑的相互作用,導致螢光信號的增強會與洗滌劑濃度成正比。此外該測定法與大多數水性緩衝液兼容,僅對於含有磷酸鹽的緩衝液除外,包括釋放磷酸鹽的分子(即 ADP 和 ATP)。因此在文獻中改以乳酸林格溶液(Lactated Ringer’s Solution)代替PBS緩衝液進行洗提流程,並且以Triton X-100在280 nm下的吸收特性去評估與定量,同時搭配標準稀釋曲線0.1%-0.0016%在 PBS-0.2 M NaCl 的控制組測定。發現在此洗滌流程之後,樣品中的Triton X-100殘留濃度低於 0.00003%,遠小於造成細胞毒性的濃度0.009% (0.15 mM)。
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圖二 CMC-535™ Aaasy (G-Bioscience)是常用於洗滌劑(Detergent)定量分析的方法
內毒素的去除總是需要仰賴一系列的處理流程, 其中”各種類型的洗滌劑”是最常用到的方式, 為避免過多的洗滌劑殘留影響產品品質, 以最少量及最簡易的流程, 從源頭端降低使用量的方法是最有效的, 而這同時也有助於去除後續對內毒素檢測的干擾。